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Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

AP.BIO:

IST-1 (EU)

,

IST‑1.P (LO)

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IST‑1.P.1 (EK)

Eine Technik, die verwendet wird, um eine spezifische Zielregion der DNA zu amplifizieren oder viele Kopien davon herzustellen.

 

Wichtige Punkte:

  • Polymerase Kettenreaktion, oder PCR, ist eine Technik, um viele Kopien einer bestimmten DNA-Region zu erstellen in vitro (in einem Reagenzglas und nicht in einem Organismus).
  • PCR basiert auf einer thermostabilen DNA-Polymerase, Taq Polymerase, und erfordert DNA Grundierungen speziell für die interessierende DNA-Region entwickelt.
  • Bei der PCR durchläuft die Reaktion wiederholt eine Reihe von Temperaturänderungen, die die Herstellung vieler Kopien der Zielregion ermöglichen.
  • PCR hat viele Forschungs- und praktische Anwendungen. Es wird routinemäßig beim DNA-Klonieren, der medizinischen Diagnostik und der forensischen Analyse von DNA verwendet.

Was ist PCR?

Polymerase Kettenreaktion (PCR) ist eine gängige Labortechnik, mit der viele Kopien (Millionen oder Milliarden!) einer bestimmten DNA-Region hergestellt werden. Diese DNA-Region kann alles sein, wofür der Experimentator interessiert ist. Zum Beispiel kann es ein Gen sein, dessen Funktion ein Forscher verstehen möchte, oder ein genetischer Marker, der von Forensikern verwendet wird, um die DNA des Tatorts mit Verdächtigen zu vergleichen.

Typischerweise besteht das Ziel der PCR darin, genug von der Ziel-DNA-Region zu machen, damit sie analysiert oder auf andere Weise verwendet werden kann. Zum Beispiel kann durch PCR amplifizierte DNA für Sequenzierung, visualisiert von Gelelektrophorese, oder geklont in ein Plasmid für weitere Experimente.

Die PCR wird in vielen Bereichen der Biologie und Medizin eingesetzt, einschließlich der molekularbiologischen Forschung, der medizinischen Diagnostik und sogar in einigen Zweigen der Ökologie.

Taq-Polymerase

Mögen DNA Replikation in einem Organismus erfordert die PCR ein DNA-Polymerase-Enzym, das neue DNA-Stränge herstellt, wobei vorhandene Stränge als Matrizen verwendet werden. Die typischerweise in der PCR verwendete DNA-Polymerase heißt Taq Polymerase, nach dem hitzetoleranten Bakterium, aus dem es isoliert wurde (Thermus aquaticus).

T. aquaticus lebt in heißen Quellen und hydrothermalen Quellen. Seine DNA-Polymerase ist sehr hitzestabil und am aktivsten um 70 °\text C70 °C70, °, Starttext, C, Endtext (eine Temperatur, bei der ein Mensch oder E coli DNA-Polymerase wäre nicht funktionsfähig). Diese Hitzestabilität macht Taq Polymerase ideal für die PCR. Wie wir sehen werden, wird bei der PCR wiederholt hohe Temperatur verwendet, um denaturieren die Matrizen-DNA oder trennen ihre Stränge.

PCR-Primer

Wie andere DNA-Polymerasen, Taq Polymerase kann nur DNA herstellen, wenn sie a Grundierung, eine kurze Sequenz von Nukleotiden, die einen Ausgangspunkt für die DNA-Synthese bietet. Bei einer PCR-Reaktion bestimmt der Experimentator die DNA-Region, die durch die von ihm gewählten Primer kopiert oder amplifiziert wird.

PCR-Primer sind kurze Stücke einzelsträngiger DNA, normalerweise etwa 202020 Nukleotide lang. In jeder PCR-Reaktion werden zwei Primer verwendet, die so gestaltet sind, dass sie die Zielregion (die zu kopierende Region) flankieren. Das heißt, ihnen werden Sequenzen gegeben, die sie an gegenüberliegende Stränge der Matrizen-DNA binden, genau an den Rändern der zu kopierenden Region. Die Primer binden an die Matrize durch komplementäre Basenpaarung.

Template-DNA:

5′ TATCAGATCCATGGAGT…GAGTACTAGTCCTATGAGT 3′ 3′ ATAGTCTAGGTACCTCA…CTCATGATCAGGATACTCA 5′

Grundierung 1: 5′ CAGATCCATGG 3′ Grundierung 2:

Wenn die Primer an die Matrize gebunden sind, können sie durch die Polymerase verlängert werden und der dazwischen liegende Bereich wird kopiert.

[Detaillierteres Diagramm mit DNA- und Primer-Direktionalität]

Die Schritte der PCR

Die wichtigsten Bestandteile einer PCR-Reaktion sind Taq Polymerase, Primer, Template-DNA und Nukleotide (DNA-Bausteine). Die Zutaten werden zusammen mit den vom Enzym benötigten Cofaktoren in einem Röhrchen zusammengestellt und wiederholten Heiz- und Kühlzyklen unterzogen, die die Synthese der DNA ermöglichen.

Die grundlegenden Schritte sind:

  1. Denaturierung (96 °\text C96°C96, °, Starttext, C, Endtext): Erhitzen Sie die Reaktion stark, um die DNA-Stränge zu trennen oder zu denaturieren. Dies liefert eine einzelsträngige Matrize für den nächsten Schritt.
  2. Glühen (555555 - 656565 °\text C°C°, Starttext, C, Endtext): Die Reaktion abkühlen, damit die Primer an ihre komplementären Sequenzen auf der einzelsträngigen Template-DNA binden können.
  3. Verlängerung (72 °\text C72 °C72, °, Starttext, C, Endtext): Erhöhen Sie die Reaktionstemperaturen so Taq Polymerase verlängert die Primer und synthetisiert neue DNA-Stränge.

Dieser Zyklus wiederholt sich 252525–353535 Mal in einer typischen PCR-Reaktion, die im Allgemeinen 222–444 Stunden dauert, abhängig von der Länge der zu kopierenden DNA-Region. Wenn die Reaktion effizient ist (funktioniert gut), kann die Zielregion von nur einer oder wenigen Kopien bis hin zu Milliarden reichen.

Das liegt daran, dass nicht nur die ursprüngliche DNA jedes Mal als Vorlage verwendet wird. Stattdessen kann die neue DNA, die in einer Runde hergestellt wird, als Vorlage in der nächsten Runde der DNA-Synthese dienen. Es gibt viele Kopien der Primer und viele Moleküle von Taq Polymerase, die in der Reaktion herumschwebt, so dass sich die Anzahl der DNA-Moleküle in jeder Zyklusrunde ungefähr verdoppeln kann. Dieses Muster des exponentiellen Wachstums ist in der Abbildung unten dargestellt.

Verwendung von Gelelektrophorese zur Visualisierung der Ergebnisse der PCR

Die Ergebnisse einer PCR-Reaktion werden in der Regel visualisiert (sichtbar gemacht) mit GelelektrophoreseGelelektrophorese ist eine Technik, bei der DNA-Fragmente mit elektrischem Strom durch eine Gelmatrix gezogen werden und DNA-Fragmente nach Größe getrennt werden. Ein Standard oder eine DNA-Leiter ist typischerweise enthalten, damit die Größe der Fragmente in der PCR-Probe bestimmt werden kann.

DNA-Fragmente gleicher Länge bilden auf dem Gel eine „Bande“, die mit dem Auge sichtbar ist, wenn das Gel mit einem DNA-bindenden Farbstoff angefärbt wird. Zum Beispiel würde eine PCR-Reaktion, die ein Fragment mit 400400400 Basenpaaren (bp) produziert, auf einem Gel so aussehen:

Linke Spur: DNA-Leiter mit 100, 200, 300, 400, 500 bp-Banden.

Rechte Spur: Ergebnis der PCR-Reaktion, eine Bande bei 400 bp.

Eine DNA-Bande enthält viele, viele Kopien der Ziel-DNA-Region, nicht nur eine oder wenige Kopien. Da DNA mikroskopisch klein ist, müssen viele Kopien davon vorhanden sein, bevor wir sie mit dem Auge sehen können. Dies ist ein wesentlicher Grund dafür, warum die PCR ein wichtiges Werkzeug ist: Sie produziert genügend Kopien einer DNA-Sequenz, um diese DNA-Region sehen oder manipulieren zu können.

Anwendungen der PCR

Mit PCR kann eine DNA-Sequenz millionen- oder milliardenfach amplifiziert werden, wodurch genügend DNA-Kopien erzeugt werden, die mit anderen Techniken analysiert werden können. Zum Beispiel kann die DNA durch Gelelektrophorese sichtbar gemacht werden, Sequenzierungoder mit Restriktionsenzymen verdaut und geklont in ein Plasmid.

Die PCR wird in vielen Forschungslabors eingesetzt und hat auch praktische Anwendungen in der Forensik, Gentests und Diagnostik. Zum Beispiel wird die PCR verwendet, um Gene, die mit genetischen Störungen assoziiert sind, aus der DNA von Patienten (oder aus fetaler DNA im Fall von pränatalen Tests) zu amplifizieren. Mit der PCR lässt sich auch im Körper eines Patienten auf ein Bakterium oder ein DNA-Virus testen: Ist der Erreger vorhanden, können möglicherweise Teile seiner DNA aus einer Blut- oder Gewebeprobe amplifiziert werden.

Beispielproblem: PCR in der Forensik

Angenommen, Sie arbeiten in einem forensischen Labor. Sie haben gerade eine DNA-Probe von einem am Tatort zurückgelassenen Haar erhalten, zusammen mit DNA-Proben von drei möglichen Verdächtigen. Ihre Aufgabe ist es, einen bestimmten genetischen Marker zu untersuchen und festzustellen, ob einer der drei Verdächtigen mit der Haar-DNA für diesen Marker übereinstimmt.

Der Marker kommt in zwei Allelen oder Versionen. Eine enthält eine einzelne Wiederholung (brauner Bereich unten), während die andere zwei Kopien der Wiederholung enthält. In einer PCR-Reaktion mit Primern, die die Wiederholungsregion flankieren, produziert das erste Allel ein 200200200 \text{bp}bpstart text, b, p, end text DNA-Fragment, während das zweite ein 300300300 \text{bp}bpstart text, b , p, Endtext DNA-Fragment:

Marker-Allel 1: Primer, die die Repeat-Region flankieren, amplifizieren ein 200 bp großes DNA-Fragment

Marker-Allel 2: Primer, die die Repeat-Region flankieren, amplifizieren ein 300 bp großes DNA-Fragment

Sie führen eine PCR mit den vier DNA-Proben durch und visualisieren die Ergebnisse durch Gelelektrophorese, wie unten gezeigt:

Das Gel hat fünf Spuren:

Erste Spur: DNA-Leiter mit 100, 200, 300, 400 und 500 bp Banden.

Zweite Spur: DNA vom Tatort, 200 bp-Band.

Dritte Spur: Verdächtige #1 DNA, 300 bp Bande.

Vierte Spur: Verdächtige #2 DNA, 200 und 300 bp Banden.

Fünfte Spur: DNA des Verdächtigen #3, 200 bp-Bande.

Die DNA des Verdächtigen stimmt mit der DNA vom Tatort an dieser Markierung überein?

Wählen Sie 1 Antwort:

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(Auswahl A)

A

Verdächtiger 111

(Auswahl B)

B

Verdächtiger 222

(Auswahl C)

C

Verdächtiger 333

(Auswahl D)

D

Keiner der Verdächtigen

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Mehr über PCR und Forensik

Bei echten forensischen DNA-Tests von einem Tatort würden Techniker eine konzeptionell ähnliche Analyse wie im obigen Beispiel durchführen. Allerdings würden eine Reihe verschiedener Marker (nicht nur der einzelne Marker im Beispiel) zwischen der Tatort-DNA und der DNA des Verdächtigen verglichen.

Außerdem gibt es bei den in einer typischen forensischen Analyse verwendeten Marker nicht nur zwei verschiedene Formen. Stattdessen sind sie hoch polymorph (poly = viele, morph = Formular). Das heißt, sie kommen in vielen Allelen vor, die in winzigen Längenschritten variieren.

Die am häufigsten verwendete Art von Markern in der Forensik, genannt kurze Tandemwiederholungen (STRs), bestehen aus vielen sich wiederholenden Kopien derselben kurzen Nukleotidsequenz (typischerweise 222 bis 555 Nukleotide lang). Ein Allel einer STR könnte 202020-Wiederholungen haben, während ein anderes 181818 und ein anderes nur 101010^11start hochgestellt, 1, end hochgestellt haben könnte.

Durch die Untersuchung mehrerer Marker, von denen jeder in vielen Allelformen vorkommt, können Forensiker einen einzigartigen genetischen „Fingerabdruck“ aus einer DNA-Probe erstellen. Bei einer typischen STR-Analyse mit 131313 Markern beträgt die Wahrscheinlichkeit eines falsch positiven (zwei Personen mit dem gleichen DNA-„Fingerabdruck“) weniger als 111 in 101010 \text{billion}billionstart text, b, i, l, l, i, o, n, Endtext^11start hochgestellt, 1, end hochgestellt!

Obwohl wir an DNA-Beweise denken mögen, die verwendet werden, um Kriminelle zu verurteilen, haben sie eine entscheidende Rolle bei der Entlastung falsch angeklagter Personen (einschließlich einiger, die seit vielen Jahren inhaftiert waren) gespielt. Forensische Analysen werden auch verwendet, um die Vaterschaft festzustellen und menschliche Überreste von Katastrophenorten zu identifizieren.

[Namensnennung und Verweise]

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Postzeit: 08.01.2021